يكي از خانواده هاي گياهي پركاربرد در فضاي سبز، خانواده تاج خروس مي باشد. اين خانواده شامل 60 گونه گياهي مي باشد كه برخي از گونه هاي آن به عنوان گل در زيبا سازي فضاي سبز استفاده مي شود. توانايي گياهان خانواده تاج خروس در پاسخ به شرايط نامناسب از جمله خاك هاي فقير، تحمل دمايي، مقاومت به خشكي سبب شده كه استفاده از آن ها را به عنوان يكي از گياهان محبوب در طراحي فضاي سبز ممكن ساخته است. لذا به منظور زيبا سازي و ايجاد مناظر دل نشين طبيعي در پارك ها و مناظر شهري در شب و ايجاد جاذبه هاي توريستي و گردشگري مي توان از اين گياهان خانواده تاج خروس تراريخت شب تاب استفاده نمود. اين اختراع شامل سه بخش عمده مي باشد؛ بخش اول مربوط به مطالعات ريزازديادي و بهينه سازي كشت بافت، بخش دوم مربوط به مطالعات انتقال مواد وراثتي و تاييد گياهان تراريخته و بخش سوم مربوط به تست هاي لومينومتري و سنجش ميزان نوردهي است.

توليد پروتئين‌هاي نوتركيب از مهمترين دستاوردهاي بيوتكنولوژي و مهندسي ژنتيك در سال‌هاي اخير بوده است. در حال حاضر نيز تقاضاي زيادي براي توليد پروتئين‌هاي نوتركيب انساني جهت درمان و تشخيص وجود دارد. پرو انسولين انساني نيز به عنوان يكي از اين پروتئين‌هاي ارزشمند، يك پروتئين مدل براي تحقيقات در زمينه مصرف خوراكي ماكرومولكول‌ها شناخته شده مورد استفاده قرار مي‌گيرد. نزديك به 8/0 درصد جمعيت جهان به نوعي از ديابت مرتبط با انسولين رنج مي‌برند. تخمين زده مي‌شود كه تعداد افراد مبتلا به ديابت در آينده نزديك دو برابر خواهد شد و تقريباً 300 ميليون نفر در 25 سال آينده به اين بيماري مبتلا خواهند شد.\n تا به حال درمان با استفاده از انسولين تنها روش موثر براي درمان ديابت نوع اول بوده است. درمان اين بيماران نيازمند تنظيم دقيق ميزان قند خون با تزريق متناوب انسولين مي‌باشد. سخت بودن تزريق به بدن توسط خود شخص بيمار، منجر به عدم رضايت بيماران از اين روش تزريق شده است. براي فائق آمدن بر اين مشكل، روشهاي مختلفي براي راحتي مصرف انسولين ايجاد شده‌اند كه شامل مصرف ريوي انسولين و مصرف از طريق بيني مي‌باشد. گرچه ممكن است اين روشها مقبول واقع شوند ولي براي جبران كاهش جذب از طريق اين روشها ميزان دز بيشتر (5 الي 20 برابر) مورد نياز است. همراه با افزايش تعداد بيماران ديابتي در دنيا، معرفي روشهاي مكمل جديد براي مصرف اين هورمون و همچنين افزايش تقاضا براي هورمون انسولين (ميزان رشد 3 الي 4 درصد در سال) قابل پيش بيني است. روبرو شدن با اين ميزان تقاضا، لزوم توسعه روشهاي ارزان، مقرون به صرفه و با ظرفيت توليد بالا را در آينده نشان مي‌دهد. مطالعات اخير نشان داده است كه كشاورزي مولكولي(Molecular Farming) در گياهان از نظر عملي، اقتصادي و ايمني، نسبت به بسياري از سيستم‌هاي معمول توليد پروتئين‌هاي نوتركيب، سودمندتر مي‌باشد. با استفاده از گياهان مي‌توان هزينه توليد پروتئين‌هاي نوتركيب را به ميزان قابل توجهي كاهش داد. بنابراين گياهان تراريخته گزينه هاي مناسبي براي توليد تركيبات دارويي و پروتئين‌هاي پيچيده انساني مي باشند.\nدر اين پژوهش از ژن پروانسولين انساني كه در ناقل بياني گياهي pCAMBIA1304 تحت كنترل پيشبرنده CaMV35S و خاتمه دهنده NOS همسانه‌سازي شده بود استفاده گرديد. سازه مورد نظر با روش استاندارد انجماد و ذوب به باكتري اگروباكتريوم منتقل شده و براي تراريختي گياه توت فرنگي از طريق اگروباكتريوم تومافاسينس و به روش تلقيح برگ، دمبرگ و جوانه هاي انتهايي اين گياه مورد استفاده قرار گرفت. علت انتخاب گياه توت فرنگي به عنوان بيوراكتور اين است كه علاوه بر وجود ويتامينهاي مختلف و مواد معدني ارزشمند در اين گياه كه طبق گقته ي پزشكان قند آن مشكلي را براي بيماران ديابتي ايجاد نمي كند، اگر هر ژني را به يك گياه انتقال دهيم بر اساس نسبت مندلي حداقل 4/1 گياهان نسل بعد غير تراريخت خواهند بود. گياه توت فرنگي به علت داشتن ساقه هاي رونده(Runner) كه يك كلون از گياه مادري مي باشد مي تواند به عنوان يك گياه مدل بسيار مناسب براي بررسي بيان ژن انتقال داده شده هدف مطرح باشد. به منظور امكان سنجي خوراكي نمودن انسولين و توليد آن در ميوه ي گياه توت فرنگي از جداكشتها ي مورد تلقيح باززايي قرارگرفت. بعد از باززايي، استخراج DNA ژنومي گياه تراريخت انجام شده و با استفاده از تكنيك PCR و بهره گيري از آغازگرهاي اختصاصي حضور ژن پروانسولين انساني در گياه تراريخت تاييد گرديد. براي بررسي نسخه‌برداري از ژن پروانسولين انساني آناليز RT-PCR از گياهان تراريخت توت فرنگي انجام پذيرفت. كه در نتيجه كل پروتئين استخراج شده از ميوه و برگهاي جوان گياه توت فرنگي تراريخت و با استفاده از تكنيك، Dot Blot، الايزا و كمي لومينسانس بيان ژن پروانسولين انساني در سطح پروتئين در ميوه توت فرنگي مورد بررسي نهايي قرار گرفت. در نهايت پروتئين توليد شده پروانسولين انساني از ميوه و برگ توت فرنگي تخليص و مورد ارزيابي قرار گرفت.\nتحقيق حاضر اولين گزارش از بيان انتقال ژن پروانسولين در ميوه توت فرنگي مي‌باشد. با توجه به نقش مهم درماني اين دارو و هزينه بالاي توليد آن از ساير منابع، تلاش براي توليد آن در ميوه ي گياه براي مصرف خوراكي، پس از انجام تحقيقات تكميلي انشاالله زمينه براي توليد ارزان‌تر و فراوان آن را فراهم مي‌سازد.\nاين دستاورد مي تواند مسير جديدي در كشاورزي مولكولي باز كند زيرا با استفاده از اين روش به غير از توليد پروانسولين انساني مي توان پروتئين هاي نوتركيب دارويي و صنعتي مهمي مانند پلاسمينوژن بافتي انساني(tPA)،اينترفرون و... را با توليد در بافت هاي گياهي و ميوه توت فرنگي به منظور توليد واكسن هاي خوراكي استفاده كرد.\n

گياهان به عنوان يكي از مهمترين بيوراكتورها و ميزبان جديدي براي توليد داروهاي زيستي، پليمرها، واكسن¬ها، آنزيم¬ها، پروتئين¬هاي پلاسما و آنتي¬بادي¬ها شناخته شده¬اند. توليد پروتئين¬هاي نوتركيب در گياهان داراي مزاياي زيادي است؛ اولاً سيستم‏هاي گياهي در مقايسه با ساير روش¬هاي صنعتي توليد (مانند باكتري¬ها، مخمرها يا لاين¬هاي سلولي كشت شده انساني و حيواني) اقتصادي¬تر هستند و قادر به توليد مقادير بسيار زيادي از پروتئين نوتركيب با قيمت ارزان مي باشند. ثانياً گياهان حاوي واكسن و يا پروتئين نوتركيب را مي توان در شرايط محيطي معمولي نگهداري نمود. همچنين گياهان توانايي انجام بعضي تغييرات پس از ترجمه را بر روي پروتئين¬هاي نوتركيب مانند سيستم¬هاي طبيعي بدن انسان دارند. علاوه بر اين¬ها به دليل آنكه گياهان ميزبان هيچ عامل بيماري¬زاي مشترك انساني نمي باشند، لذا خطر امكان انتقال بيماري از گياهان به انسان غيرممكن يا حداقل است. در بدن انسان تأمين اكسيژن و مواد غذايي و خارج نمودن مواد زائد، به كمك دستگاه گردش خون انجام مي‌شود. همچنين رگ‌زايي براي رشد و بهبود بافت¬ها و ترميم زخم¬ها مورد نياز مي‌باشد. فرايند رگ¬زايي در بدن به شدت كنترل مي¬شود و مكانيسم¬هاي دقيق و پيچيده¬اي در ارتباط با اين پديده وجود دارد، با اين حال رگ¬زايي بيش از حد و نابجا و يا رگ¬زايي ناقص در بسياري از بيماري¬ها مانند سرطان، مشاهده مي شود. همچنين به كمك سيستم گردش خون، سلول‌هاي سرطاني در سراسر بدن پخش شده و متاستاز صورت مي‌گيرد. گيرنده 2 فاكتور رشد اندوتليال عروقي(VEGFR-2) مهمترين و شناخته شده‌ترين عامل براي ايجاد عروق خوني جديد در بدن انسان است. در عين حال، VEGFR-2 يك آغازگر اصلي در رگ¬زايي تومورها بوده و فاكتور اصلي در رشد و متاستاز تومورهاي سرطاني به¬شمار مي آيد. در بسياري از تومورهاي سفت مانند ملانوما، پستان، سرطان كولون، كليه، مثانه، تخمدان، پروستات و لوسمي-ها افزايش بيان VEGFR-2 گزارش شده است، بدين جهت اين پروتئين مي¬تواند هدف مناسبي براي درمان سرطان باشد. در اين پژوهش ژن فيوز شده نانوبادي ضد VEGFR-2 و توكسين PE38 به كلروپلاست گياه توتون منتقل گرديد. بدين منظور توالي نانوبادي ضد VEGFR-2 بر اساس ترجيح كدوني كلروپلاست توتون تغيير داده شده و براي افزايش كارايي نانوبادي، توكسين PE38 سودوموناس با كمك اتصال دهنده به آن متصل شده و به ناقل كلروپلاستي منتقل گرديد. اين ناقل داراي منطقه تنظيمي psbA و قسمت 5’ UTR آن، ژن آنتي¬بيوتيك aadA و پيشبرنده Prrn بود. براي نوتركيبي همولوگ نيز از مناطق جانبي (trnI/trnA) طبيعي توتون استفاده گرديد. انتقال ژن به گياه با روش بيوليستيك انجام شده و باززايي گياهان تراريخت و غربالگري آن ها با كمك آنتي¬بيوتيك اختصاصي صورت گرفت. به منظور رسيدن به هموپلاسمي كامل در گياهان ترانسپلاستوميك حداقل سه بار باززايي انجام شد. بعد از باززايي، استخراج DNA ژنومي گياه تراريخت انجام شده و با استفاده از تكنيك PCR حضور ژن نوتركيب در گياه تراريخت تاييد گرديد. براي بررسي انجام نسخه‌برداري ژن فيوز شده نانوبادي ضد VEGFR-2 و توكسين PE38 آناليز RT-PCR از گياهان تراريخت توتون انجام پذيرفت. كه در نتيجه كل پروتئين از برگهاي گياه تراريخت استخراج شده و با استفاده از تكنيك هاي Dot Blot، الايزا و Western blot بيان ژن نوتركيب مورد بررسي نهايي قرار گرفت. مصرف آنتي¬بادي¬هاي با اهداف تشخيصي و درماني روز بروز افزايش مي يابد و ايجاد يك سيستم كارا به منظور توليد انبوه و ارزان آن ها ضروري است، لذا بهره برداري از بيوراكتورهاي گياهي ضرورتي اجتناب ناپذير است. با توجه به اينكه تاكنون گزارشي در مورد انتقال پايدار كلروپلاستي نانوبادي VEGFR-2 متصل به توكسين PE38 به هيچ گياهي گزارش نشده است، اين دستاورد مي تواند مسير جديدي در كشاورزي مولكولي باز كند.

گياهان به عنوان يك جايگزين اميدبخش براي تخمير ميكروبي و كشت سلول هاي جانوري جهت توليد پروتئين هاي نوتركيب پيشنهاد شده اند، براي اينكه مزايايي همچون ايمني بالا، هزينه پايين، تغييرات پس از ترجمه حجم بالاي توليد دارند. قيمت تمام شده توليد پروتئين هاي نوتركيب در گياه در مقايسه با سيستم هاي ديگر در حدود يك دهم تا يك صدم است. tPA، فعال كننده اصلي پلاسمينوژن در خون مي باشد در صورتي كه نقش اصلي uPA پروتئوليز وابسته به بافت است و عقيده بر اين است كه نقش آن در حذدف فيبرين داخل عروقي نسبت به tPA، ثانويه مي باشد. فيبرينوليز عمدتا در سطح فيبرين آغاز و منتشر مي شود زيرا اين سطح محل هاي اتصال براي تماس بهينه بين تعدادي از اجزاي سيستم فبرينوليتيك به خصوص پلاسمينوژن و tPA را مهيا مي كند. اين اثر تحريكي، غلظت بالايي از پلاسمينوژن و tPA را در رسوبات فيبرين به وجود مي آورد و موجب متمركز شدن فعاليت پلاسمين در اين ناحيه مي گردد. در اين پژوهش ژن tPA پس از جداسازي در ناقل بياني گياهي مناسب (pBI121) كلون گرديد. ژن مورد نظر با استفاده از آگروباكتريوم به گياهان توتون منتقل گرديد. گياهان تراريخت در محيط كشت انتخابي حاوي آنتي بيوتيك هاي كانامايسين (100mg/l) و سفاتاكسيم (200mg/l) باززايي شدند. آناليز ملكولي PCR بر روي DNA ژنومي استخراج شده از گياهان باززايي شده با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي، انتقال ژن tPA را به گياهان باززايي شده تأييد كرد. توليد پروتئين نوتركيب فعال tPA با استفاده از آناليزهاي SDS-PAGE و زيموگرافي اثبات گرديد. بعد از باززايي كلا 45 گياه با منشأ متفاوت به دست آمد كه از اين تعداد 21 گياه نرمال بودند. اين گياهان ايزوله گرديدند و به زور جمع آوري شده از گياهان تراريخت در محيط كشت MS حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين (با غلظت 50mg/lit) كشت گرديدند و جهت تهيه گياهان نسل T1 مورد استفاده قرار گرفتند. آزمايشات مولكولي و بيوشيميايي توليد پروتئين نوتركيب فعال tPA را در گياهان باززايي شده در نسل T1 تأييد كرد. با استفاده از نرم افزار Photocapt و محاسبه سطح زير منحني مربوط به باند اضافي مربوط به SDS-PAGE در گياهان تراريخت ميزان tPA در كل پروتيين قابل حل، محاسبه گرديد. نتايج نشان داد كه ميزان بيان پروتئين نوتركيب از 1/012٪ تا 1/26٪ در كل پروتئين قابل حل متغير است. اين اولين گزارش از توليد پروتئين نوتركيب و همچنين اولين گزارش توليد tPA در گياه در دنيا مي باشد.

توليد زيست داروها و پروتئين هاي مهم كاربردي از طريق گياهان ما را قادر به توليد پروتئين هاي دارويي ارزان تر و ايمن تر مي نمايد. تحقيقات نشان داده است كه گياهان پتانسيل بالايي در توليد نامحدود آنتي بادي هاي نوتركيب، واكسن ها و ساير پروتئين هاي نو تركيب دارند و از زمان پيدايش اين تكنيك، پروتئين هاي نوتركيب مختلفي با ويژگي هاي متنوع در گياهان توليد شده است. اخيرا ديده شده است كه شترهاي دنياي قديم و از جمله شتر دوكوهانه (Camelus bactrianus) قادر به توليد آنتي باديهايي مي باشند كه از ساير آنتي بادي هاي پستانداران متفاوت بوده و امروزه دانشمندان معتقدند كه اين پروتئين ها مي توانند به حل بسياري از چالشهاي موجود در فناوري زيست دارويي كمك بنمايند. براي اولين بار در جهان جداسازي و توليد آنتي بادي مونوكلوتال عليه آنتي ژن موسين (تومور ماركر شايع در سرطان پستان، تخمدان، ريه، پانكراس و پروستات) از منشاء شتر دو كوهانه صورت گرفت. سپس ژن اين پروتئين نوتركيب با كمك PCR و آغازگرهاي طراحي شده تكثير گرديد و در وكتور T/A كلون گرديد و پس از توالي يابي و بررسي آن در وكتور عمومي بياني گياهي pBI121 جايگزين ژن GUS گرديد. اين سازه ابتدا به باكتري E.coli جهت نگهداري و سپس به آكروباكتريوم نژاد LBA4404 جهت تراريخت نمودن گياهان توتون وارد گرديد. با استفاده از تكنيك transformation agrobacterium-mediated ژن اين پروتئين نوتركيب به گياه تنباكو منتقل شد و گياهان تراريخت روي محيط كشتهاي حاوي آنتي بيوتيك باززايي شدند. آناليز ژنتيكي (حضور اين ژن در DNAA ژنومي گياهان باززايي شده با كمك PCR) و آناليز پروتئيني (وسترن بلاتينگ) نشان داد كه اين پروتئين نوتركيب در گياه بيان توليد مي شود. در نهايت پروتئين گياهي استخراج گرديد و با استفاده از تكنيك ELISA ديده شد كه اين پروتئين براحتي و با اختلاف قابل توجهي مي تواند پپتيدهاي ساختگي مربوط به اين تومورماركر را بشناسد. همچنين تست نهايي نشان داد كه عصاره پروتئين گياهي حاوي اين پروتئين نوتركيب با اختلاف قابل چشمگيري مي تواند سلول نرمال را از غير نرمال تشخيص دهد. براي اطمينان اين آزمايشها چند بار تكرار گرديد كه حاكي از توليد صحيح و فعاليت بيولوژيكي اختصاصي اين نانو بادي جهت شناسايي تومورماركر موسين (رايج در بسياري از سلولهاي سرطانها) مي باشد. اين ژن اولين ژن از كلاس جديد آنتي بادي شتري است كه از شتر دوكوهانه جدا گرديده است و اين پژوهش، اولين گزارش از توليد كوچكترين پروتئين آنتي بادي نوتركيب (نانو بادي) يا منشا شتر دو كوهانه عليه تومور ماركر بسياري از سلولهاي سرطاني در گياه مي باشد.